Лізис клітин циклами «заморожуванням-відтаювання» – перспективний підхід до створення безклітинних кріоконсервованих біологічних засобів – кріоекстрактів фрагментів органів ссавців

Гладких, Ф.В.

Home
→
PUBLICATIONS
→
PUBLICATIONS
→
View Item

Лізис клітин циклами «заморожуванням-відтаювання» – перспективний підхід до створення безклітинних кріоконсервованих біологічних засобів – кріоекстрактів фрагментів органів ссавців

Гладких, Ф.В.

URI: https://doi.org/10.5281/zenodo.14049968
https://pubmed.com.ua/xmlui/handle/123456789/1100

Date: 2024-10-18

Abstract:

Гладких ФВ. Лізис клітин циклами «заморожуванням-відтаювання» – перспективний підхід до створення безклітинних кріоконсервованих біологічних засобів – кріоекстрактів фрагментів органів ссавців. Матеріали X науково-практичної конференції з міжнародною участю «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів»; 17–18 жовтня 2024; Тернопіль: Тернопільський національний медичний університет імені І. Я. Горбачевського МОЗ України; 2024, с. 162–164. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.14049968

Description:

Лізис клітин – це метод, при якому зовнішня клітинна мембрана руйнується для вивільнення з клітини внутрішньоклітинних компонентів, таких як ДНК, РНК, білок або органели [1]. Прогнозується, що глобальне зростання ринку лізату клітин сягне 4,1 млрд. доларів до 2026 р. [2]. Методи лізису клітин можна класифікувати на механічні та немеханічні, а немеханічний лізис в свою чергу можна розділити на три основні групи – фізичний (термічний, осмотичний, ультразвукова кавітація), хімічний (лугами, поверхнево-активними речовинами) та біологічний (ферментативний) [1]. Мета. Охарактеризувати сучасні підходи до створення безклітинних кріоконсервованих біологічних засобів – кріоекстрактів фрагментів органів ссавців дією низьких температур за даними відкритих джерел інформації. Матеріали та методи дослідження. Підбір публікацій виконано за базами даних PubMed, Clinical Key Elsevier, Cochrane Library, eBook Business Collection та Google Scholar, у яких висвітлювались відомості про отримання екстрактів клітин за ключовими словами: кріоекстракт, лізис клітин, заморожування-відтаювання. Результати. Продукти клітинного походження, включаючи позаклітинні везикули, клітинний лізат та кондиціоноване середовище, які містять багато біоактивних речовин, стають все більш популярними у дослідженнях та клінічних випробуваннях. Клітинні екстракти настільки ж ефективні в медицині, як й цільні клітини, що підтверджує концепцію, що клітини можуть реагувати вивільненням внутрішніх біомолекул [3, 4]. Клітинний екстракт являє собою гетерогенну суміш, виділену з розчинних компонентів клітинних лізатів. Він містить білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди, вуглеводи та органели клітин [5]. Клітинні екстракти можна отримати з усіх типів клітин шляхом руйнування їх мембран. Протягом багатьох років лізис клітин використовувався як етап фракціонування клітин, ізоляції органел, екстракції та очищення білка. З виділенням та ідентифікацією різних білків, ліпідів та генетичних матеріалів було встановлено їх вирішальну роль у регенеративній медицині та лікуванні захворювань [4]. На сьогодні, застосування екстрактів клітин активно вивчається як спосіб лікування різних захворювань, включаючи загоєння ран, інфаркт міокарда та ішемічний інсульт, гострий мієлоїдний лейкоз, гострий коліт, остеорадіонекроз, хвороба Альцгеймера, пошкодження нервів, ожиріння, захворювання печінки, синдром Шегрена та ін. [4]. Метод заморожування-відтаювання зазвичай використовується для лізису клітин бактерій та ссавців. Техніка передбачає заморожування клітинної суспензії у ванні з сухим льодом/етанолом або морозильнику, а потім розморожування матеріалу при кімнатній температурі або 37°C. Цей метод лізису змушує клітини набухати і зрештою руйнуватися, оскільки кристали льоду утворюються під час процесу заморожування, а потім збільшуються під час відтавання. Для ефективного лізису необхідні кілька циклів, і процес може бути досить тривалим. Проте було показано, що заморожування-відтавання ефективно вивільняє рекомбінантні білки, розташовані в цитоплазмі бактерій, і в деяких протоколах рекомендується для лізису клітин ссавців [6]. У роботі Tangporncharoen R. та співав. (2024 р.) [3] для приготування екстрактів клітини обробляли трипсином та двічі промивали буферним розчином перед центрифугуванням. Осад ресуспендували у фізіологічному розчині та доводили до концентрації 4000 клітин/мкл. Клітинну суспензію заморожували на годину та відразу розморожували при 37 °C. Процес повторювався 3 рази. Після третього циклу суміш інгібіторів протеази додавали до всього клітинного лізату, який потім центрифугували при 12000 g при 4 °C. Супернатант збирали та зберігали при -20 °C. У дослідженні Rajasingh J. та співав. [7] клітини промивали фосфатно-сольовим буфером та буфером для лізису клітин (100 мМ HEPES, pH 8,2; 50 мМ NaCl; 5 мМ MgCl2; 1 мМ дитіотреїтол та інгібітори протеази), осаджували при 10 тис. об/хв., повторно суспендували в 1 об’ємі холодного буфера для лізису клітин та інкубували протягом 30–45 хв на льоду. Клітини обробляли ультразвуком на льоду в 200-мкл аліквотах, за допомогою зондому діаметром 3 мм, доки всі клітини та ядра не були лізовані, як було визначено за допомогою мікроскопії. Лізат осаджували при 12 тис. об/хв протягом 15 хвилин при 4°C для утворення гранул. Супернатант ділили на аліквоти, заморожували в рідкому азоті та зберігали при -80°C. Стандартизували за концентрацією білка. У серії робіт Su X. та співав. [4] клітини ресуспендували в 0,9% фізіологічному розчині до концентрації 107 клітин/100 мкл. Потім було проведено 3 цикли заморожування (–80°C) та відтавання (+37°C) для лізису клітин. Після центрифугування при 17000 g протягом 30 хвилин при 4 °C супернатант (визначений як клітинний екстракт) зберігали при –80 °C до використання. Висновки. Метод заморожування-відтаювання є одним з оптимальних підходів до отримання клітинних екстрактів з використанням стандартних матеріалів.

Show full item record